人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

　　　　　　　　　　　　　　 作者：王凯，温伟红，王涛，张瑞，秦炜炜，雷小英，杨安钢

【关键词】 HER2；，单链抗体；，鱼精蛋白

　　Construction and expression of human antiHER2 ScFv/Ck/tP fusion protein in E.coli and identification of its activity

　　【Abstract】 AIM: To construct a fusion protein gene of human antiHER2 ScFv/light chain constant region/truncated protamine (ScFv/Ck/tP) and analyze the binding activity of the expressed protein. METHODS: Two pairs of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the ScFv and the Ck gene. After they were linked as ScFv/Ck， the synthesized tP coding sequence was added in the 3′ terminus of it， then the fusion protein gene ScFv/Ck/tP was cloned into expression vector pET32a and expressed in E. coli BL21 (DE3). Expressed protein was detected by SDSPAGE and Western Blot and purified by NiNTA chelating agarose. The antigenbinding activity of the ScFv/Ck/tP fusion protein was confirmed by cellular ELISA， and the DNA binding ability was confirmed by gel shift assay. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that ScFv/Ck/tP was correctly cloned into expression vector. SDSPAGE and Western Blot analysis showed that ScFv/Ck/tP fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21. Cellular ELISA confirmed that it had specific antigen binding activity; gel shift assay assured that it had DNA binding ability. CONCLUSION: The ScFv/Ck/tP fusion protein expressed in E. coli could specially bind with both HER2 antigen and DNA.

　　【Keywords】 HER2; single chain antibody; protamine

　　【摘要】 目的：构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区（Ck）/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性. 方法：设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck)，连接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，连接于ScFv/Ck末端，构建成ScFv/Ck/tP融合基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达产物经SDSPAGE和Western Blot鉴定后，用NiNTA螯合层析介质纯化. 细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性，凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性. 结果：成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性，同时具有结合DNA的能力. 结论：ScFv与Ck，tP融合后，同时具有抗原和DNA结合活性，为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.

　　【关键词】 HER2；单链抗体；鱼精蛋白

　　0　引言

　　HER2是癌基因erbB2/neu的表达产物，在乳腺癌、卵巢癌等多种人类肿瘤细胞中高度表达，是目前公认的肿瘤细胞表面的特异性标志分子［1-2］. 单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)和亲代抗体相比，具有分子小、穿透力强、免疫原性低的特点，日益成为诊断和治疗的良好导向载体 ［3-4］. 鱼精蛋白是一种碱性蛋白，能与核酸结合［5］. 鱼精蛋白截短体(truncated protamine，tP)是一段长22个氨基酸的短肽，它保留了富含碱性氨基酸的序列，同样具有核酸结合功能. 我们将抗HER2 ScFv基因和tP编码序列融合，同时为了避免ScFv和tP之间空间结构的相互影响，在其间插入了一段轻链恒定区编码序列（kappa light chain constant region， Ck），以期获得同时具有抗原和核酸结合活性的ScFv/Ck/tP融合蛋白，核酸与该融合蛋白结合后，在其引导下，有望实现核酸的靶向输送，旨在为该ScFv在HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗的应用中奠定基础.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　质粒pCMVe23sFvPEIIGrBa［6］，pComb3HFab15，pUC19，pET32a；大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞系SGC7901（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美国Promega公司）；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HiTrap NiNTA螯合层析介质(美国Invitrogen公司)；6 His mAb（德国Qiagen公司）；HRP－羊抗鼠IgG（武汉博士德生物有限公司）；ECL化学发光试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；标准胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）.

　　1.2方法

　　1.2.1引物和tP编码序列寡核苷酸的设计与合成

　　设计扩增ScFv基因的引物 S5： 5′tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3′，S3：5′tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3′，在两端引物中分别引入EcoR I和Xho I酶切位点（下划线部分）. 扩增Ck序列的引物 Ck5： 5′tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3′，Ck3：5′ttttctagactaacactctcccctgttga3′，在两端引物中分别引入Xho I和Xba I酶切位点（下划线部分）. tP编码序列寡核苷酸合成 tP1：5′ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc 3′，tP2：5′tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgctt
cctccgcctcgcgccgg3′，寡核苷酸链的两端带有Xba I和Not I酶切位点的粘端序列（下划线部分），能够直接与经Xba I和Not I酶切的载体连接. 引物和寡核苷酸由北京奥科生物技术有限公司合成.

　　1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重组表达载体的构建及鉴定

　　分别以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pComb3HFab15质粒为模板， S5，S3和Ck5，Ck3为引物PCR扩增ScFv和Ck片段，产物经相应的酶切后，一起克隆入pUC19质粒，并进行序列测定，测序正确后的质粒命名为pUC19ScFv/Ck. 将合成的两条tP编码序列寡核苷酸链缓慢退火后，与从pUC19ScFv/Ck质粒用EcoR I和Xba I切下的ScFv/Ck片段一起连接入经EcoR I和Not I双酶切的pET32a载体，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆，酶切鉴定，对酶切鉴定正确的克隆交由北京奥科生物技术有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pET32aScFv/Ck/tP.

　　1.2.3ScFv/Ck/tP融合基因的诱导表达及鉴定

　　将鉴定正确的重组质粒pET32aScFv/Ck/tP转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃过夜培养，次日以1∶100接种，37 ℃培养至A600 nm达0.6左右，加入IPTG终浓度为0.5 mmol/L，诱导培养3 h，取5 mL未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以100 mmol/L Tris・HCl (pH 8.0)重悬，超声裂菌后离心，取少量上清加入等量2×SDS上样缓冲液，沉淀重悬于适量1×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，离心后取上清进行SDSPAGE分析，凝胶薄层扫描分析蛋白表达情况. 同时对表达产物进行Western Blot鉴定，蛋白样品经SDSPAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜，以5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，依次加入鼠抗6 His mAb（1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜），HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释，室温1 h)，用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.

　　1.2.4表达产物的分离纯化

　　取200 mL诱导菌离心后收集菌体，用100 mmol/L Tris・HCl (pH 8.0)重悬，冰浴中温和超声6次（每次2 min，间隔10 s）破碎菌体，4 ℃，10 000 g离心5 min，收集上清过0.45 μm滤膜，用镍次氨基三乙酸(Ni2+NTA)螯合层析介质室温结合1 h，用洗涤缓冲液（100 mmol/L Tris・HCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗涤5次后，分别用含100，200，500 mmol/L的咪唑洗脱缓冲液洗脱. 各取少量不同组洗脱液加入等量2×SDS Loading Buffer，煮沸5 min，离心后取上清进行SDSPAGE分析.

　　1.2.5表达产物的抗原结合活性检测

　　采用细胞ELISA的方法. 胰酶消化生长铺满的SGC7901细胞，重悬于含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞密度为5×108/L ，以100 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养24 h， 细胞充分贴壁生长. 40 g/L 多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次. 每孔加入100 μL含30 mL/L H2O2 PBS，室温反应20 min，PBS洗3次. 在细胞包被孔中分别加入不同稀释度的蛋白样品，每孔100 μL，设复孔，阴性对照，37℃孵育1 h，依次加入鼠抗6 His mAb(1∶1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5000稀释）孵育，TMB显色，终止反应后测定各孔A450 nm值.

　　1.2.6表达产物的DNA结合活性检测

　　采用凝胶迁移阻滞实验. 将1 μg质粒DNA分别与不同量的ScFv/Ck/tP融合蛋白于0.2 mol/L NaCl溶液中室温孵育30 min，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，观察结果.

　　2　结果

　　2.1重组表达载体的构建及鉴定

　　PCR分别扩增出长度为720 bp的抗HER2 ScFv基因片段(图1A)和长度为330 bp的Ck片段(图1B)，与预期长度一致，克隆入pUC19载体后，经测序证实序列与设计序列完全相符. 用EcoR I和Xba I切下ScFv/Ck片段后，与合成的tP寡核苷酸退火产物一同连接入经EcoR I和Not I双酶切的pET32a载体，重组质粒经EcoR I和Not I双酶切后，出现长度为1130 bp左右的片段(图1C)，与预期的ScFv/Ck/tP片段长度一致，经测序证实序列与设计序列完全相符，表明重组原核表达质粒构建成功.

　　2.2ScFv/Ck/tP融合蛋白的诱导表达及鉴定

　　与空载体相比，经0.5 mmol/L IPTG诱导后细菌裂解上清及沉淀中均出现Mr约为60 ku的新生蛋白带，与预期的ScFv/Ck/tP融合蛋白Mr相符. 光度扫描显示目的蛋白的表达量占上清蛋白的48.8% ，经Western Blot分析证实，新生蛋白带即为带有6 His标签的ScFv/Ck/tP融合蛋白，提示目的蛋白表达成功，且以可溶性表达为主（图2）.

　　2.3ScFv/Ck/tP融合蛋白的纯化SDSPAGE显示

　　ScFv/Ck/tP融合蛋白得到有效纯化，经薄层扫描分析纯度分别达到90%以上(图3). 用BCA法测定纯化蛋白的平均浓度分别为400 μg/mL.

　　2.4ScFv/Ck/tP融合蛋白的抗原结合活性检测细胞ELISA检测结果显示：

　　随着稀释度的增加，ScFv/Ck/tP融合蛋白与抗原的结合减弱，提示表达的融合蛋白能与SGC7901细胞表面的HER2抗原特异性结合，并且与ScFv相比，ScFv/Ck/tP融合蛋白的结合活性无明显差别，说明Ck，tP的融合对ScFv的结合活性没有显著影响（图4）.　　

　　2.5ScFv/Ck/tP融合蛋白的DNA结合活性检测凝胶迁移阻滞实验结果显示：

　　ScFv/Ck/tP融合蛋白与质粒DNA作用后，可以使DNA的迁移速率变慢，并且ScFv/Ck/tP融合蛋白含量越高，DNA的迁移速率越慢，提示该融合蛋白能够与DNA结合（图5）.

　　3　讨论

　　HER2分子是与肿瘤生长、 侵袭、 转移有关的重要分子，在多种肿瘤中高度表达且与患者预后密切相关，是目前公认的肿瘤细胞表面的特异性标志分子［1-2］. 研究证实，以HER2分子为靶点的导向生物治疗，能够抑制多种肿瘤恶性表型，对肿瘤进行有效控制［7］. 完整抗体分子因其较强的免疫原性和较弱的组织穿透性，临床应用受到限制. ScFv将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段柔性短肽连接起来，由于只保留了V区，免疫原性大大降低，同时由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，减少了抗体的非特异性结合而更集中到达特定部位，因而成为导向药物的理想载体［3-4］. ScFv可与其他效应分子融合构建成多种具有双重功能的分子，最常见的如免疫毒素、双特异抗体、放射性同位素标记的ScFv等［8］. 目前，部分ScFv及其衍生物已进入临床I，II期试验阶段［9］.

　　鱼精蛋白最初发现于精子细胞，它能够将基因组DNA集中在精子的头部，保证遗传信息的传递［4］. tP也能够与DNA结合，这与它所具有的碱性氨基酸序列有关［5］. 我们将抗HER2 ScFv与tP融合，同时为了避免两个结构域之间空间结构的相互影响，又在两个基因之间插入了一段Ck，以期获得既有抗原结合活性，又同时具有DNA结合活性的ScFv/Ck/tP融合蛋白，DNA与ScFv/Ck/tP融合蛋白结合后可以在ScFv引导下到达特定组织，并在特定组织内表达，不仅可以降低免疫原性，还可直接在体内获得有活性的蛋白，将更有利于进一步应用［10］.目前，单链抗体表达主要的宿主体系为大肠杆菌，由于大肠杆菌遗传背景清楚、培养操作简单、成本低廉，加之小分子抗体不存在Fc段糖基化修饰问题，故较适合小分子抗体的表达. 我们将重组的pET32aScFv/Ck/tP表达载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后ScFv/Ck/tP融合蛋白以可溶性表达为主，表达量占上清蛋白的40% 以上，利用载体pET32a上的6 His融合标签，我们采用Ni2+NTA螯合层析介质成功的从表达菌裂解上清中纯化出了高纯度的融合蛋白. 和ScFv相比，ScFv/Ck/tP融合蛋白与HER2抗原的亲合活性没有显著差别，同时具有DNA结合活性，为该ScFv用于靶向输送DNA或siRNA的研究奠定了基础.

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