肌源神经营养因子修复大鼠周围神经损伤

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 作者：　张连斌，刘颖， 初向阳，鄂玲玲，王波

【关键词】 周围神经损伤

　　Musclederived neurotrophic factor used in repairing peripheral nerve injury in rats

　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of musclederived neurotrophic factor (MDNF) in repairing peripheral nerve injury in rats. METHODS: MDNF was extracted from adult rat skeletal muscle， and 10 μL MDNF (0.1 mg/L) and 10 μL sodium solution were respectively injected into the injured sciatic nerve segments. Sodium solution group and normal rats were employed as controls. The morphologic observation and stereological measurement of regenerated nerve were evaluated by HRP retrograde tracing method and Nissls staining and trichrome staining techniques. RESULTS: Some regenerated fibers passed through the injected sciatic nerve segments in MDNF group. The morphologic observation and stereological measurement of nerve regeneration by MDNF injection were better than those in sodium solution group. CONCLUSION: MDNF can promote the regeneration of injured peripheral nerves.

　　【Keywords】 neurobiology; musclederived neurotrophic factor; peripheral nerve scathe; peripheral nerve regeneration; HRP; rat

　　【摘要】 目的：观察肌源神经营养因子（MDNF）对大鼠周围神经损伤修复的影响. 方法：从成鼠骨骼肌中提取出MDNF，取10 μL MDNF（0.1 mg/L）注射到大鼠坐骨神经损伤段为实验组，同时设实验对照组（注射生理盐水）和正常对照组. 术后20 d用辣根过氧化物酶示踪法（HRP）、尼氏染色法、特殊三色染色法对再生神经进行形态学观察和计量学统计. 结果：注射MDNF的周围神经损伤部有再生的神经纤维通过；MDNF组的再生神经在形态学及计量学上均优于生理盐水组. 结论: 肌源神经营养因子对周围神经损伤后的修复有较好的促进作用.

　　【关键词】 神经生物学；肌源神经营养因子； 周围神经损伤； 周围神经再生； 辣根过氧化物酶；大鼠

　　0引言

　　周围神经系统具有一定的再生能力. 但是，无论怎样精确的神经修复，其功能都很难再恢复到损伤前的水平［1］. 通过提高外科手术技术、电或磁的刺激［2］、组织的摘除以及雪旺氏细胞的巧妙处理等方法来促进周围神经损伤后的修复工作已做了很多. 最近，对神经营养因子的分子通路以及生理作用的理解有了重大的进展. 这些因子包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3，4，5，6以及胶质源性神经营养因子等等，它们影响着不同的神经细胞亚群，在中枢和周围神经系统中均有着复杂的营养作用. 许多研究表明，骨骼肌组织中也存在着对神经元有营养作用的物质. Oppenheim等将从大鼠的这种物质中分离出的Mr为10 000~30 000组份蛋白命名为“肌源神经营养因子” （musclederived neurotrophic factor，MDNF），它能促进胚胎脊髓运动神经元生长，并对其损伤具有保护作用［3］. 我们通过辣根过氧化物酶示踪法、尼氏染色法、特殊三色染色法观察MDNF对坐骨神经损伤后修复的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Wistar大鼠（军事医学科学院动物中心提供）;Tyrode溶液，低温高速离心机（上海华亭TGL16G）;中空纤维超滤器（Ultrafiltration with the Porous Fiber tubers，北京宣武超滤设备厂）;电脑自动记录仪记录（上海沪西仪器厂）;电泳仪（北京六一电泳仪器厂）;HRP（中山公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1成鼠MDNF的制备用80只成年Wistar大鼠，切取四肢，在手术显微镜下剥离骨骼肌组织块. 骨骼肌组织用Tyrode溶液浸泡（1∶5）后，再经超声粉碎、低温高速离心30 min得上清液. 经中空纤维超滤器截取Mr为10 000~50 000的蛋白液，然后在层析柜内过交联葡聚糖（Sephadex）G75（Pharmacia产品）层析柱，柱长1 m，用PBS平衡液洗脱，流速为0.3 mL/min，自动收集器收集，紫外检测，波长280 nm，电脑自动记录仪记录. 层析预截取的Mr 10 000~30 000洗脱液经冷冻干燥后，进行十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺梯度凝胶，中范围分子质量标准蛋白做对照（Pharmacia）. 电压150 V，0.5~1 h，硝酸银染色.

　　1.2.2动物分组及手术方法雄性健康Wister大鼠18只，体质量250 g左右，随机分成实验组、实验对照组和正常对照组，每组6只. 用异戊巴比妥钠麻醉剂腹腔注射麻醉（2.5 mL/kg），于大鼠右侧股后部正中切口，在手术显微镜下解剖坐骨神经，自梨状肌下缘夹伤坐骨神经30 s，直至夹伤段仅有透明的神经外膜. 实验组用100 mg/L的MDNF 10 μL注入夹伤处，实验对照组注射生理盐水10 μL. 正常对照组未经任何注射，术后各组大鼠按常规饲养20 d.

　　1.2.3检测方法① HRP示踪试验：各组随机抽取大鼠2只，于夹伤处远端4 mm处的坐骨神经干注入150 g/L的HRP溶液10 μL，缝合好伤口，继续饲养72 h，多聚甲醛灌注后取腰段脊髓固定，振动切片，进行四甲基联苯胺法染色，观察各组HRP标记的情况. ②Nissl染色：各组大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注，取脊髓腰段，石蜡包埋，切片，展片后进行尼氏染色，观察神经元胞体数. ③特殊三色染色：各组大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注后，取坐骨神经夹伤段、坐骨神经夹伤远端、近端，石蜡包埋连续切片，夹伤段纵切，远、近端既纵切，又横切，观察神经再生、髓鞘形成情况，计量学分析远、近端的轴索数，远端的轴索直径和髓鞘厚度.

　　2结果

　　2.1HRP示踪试验MDNF组HRP标记神经元数与其余二组均有显著性差异（P<0.01，表1）.

　　2.2Nissl染色Nissl染色后，实验组脊髓前角运动神经元数与实验对照组有差异（P<0.05），两组与正常对照组均有显著性差异（P<0.01，表1）.表1HRP标记和Nissl染色脊髓运动神经元数据(略)

　　2.3特殊三色染色实验组和实验对照组坐骨神经夹伤20 d时，两组坐骨神经夹伤段的远端、近端都不同程度地发生了Waller变性. 实验组（图1，2）和实验对照组（图3）近端的神经纤维损伤分别比远端轻. 在近端横切面中还能看到大量的正常的有髓神经纤维，轴索被染为绿色点状，轴索四周的髓鞘被染成红色（图1）；纵切面中能见到大量的正常有髓神经纤维，染成红色的为髓鞘，在红色髓鞘的中间有一条绿色的细线为轴索，纵切面中也能见到正在变性和已变性的没被染成红色的神经纤维（图2，3）. 在变性的神经纤维神经膜管的内面还能见到少量的Schwann细胞（图2）. 实验组（图1）、正常对照组（图4）、实验对照组近端轴索数没有差异（表2）.表2有髓神经纤维组织形态学分析结果（略）

　　实验组（图5，6）和实验对照组（图7，8）远端的神经纤维损伤很重. 在实验对照组横切面上（图7）能见到大量的变性神经纤维，绿色点状轴索和红色髓鞘少见；在实验组（图5）也能见到变性神经纤维，但绿色轴索和红色髓鞘较多. 在纵切面上，实验组（图6）神经纤维因损伤髓鞘腔崩解，髓鞘断裂成为分节状结构，在神经膜区域内仍可见大量块状髓鞘碎片，神经膜管有的萎缩、变窄，大量的Schwann细胞在神经膜管的内面形成Büngner带；实验对照组（图8）神经纤维髓鞘碎片已不成块状，呈松驰状，大部分都已消失，神经膜管都已萎缩、变窄，大量的Schwann细胞在神经膜管的内面形成Büngner带. 实验组和实验对照组远端轴索数、轴索直径和髓鞘厚度有差异（P<0.05），两组均与正常对照组有显著性差异（P<0.01）. 实验组损伤段（图9，10）纵切面上能见到许多髓鞘腔和Schwann细胞，一些髓鞘腔内有少量的红色的髓鞘（图10）；对照实验组损伤段（图11，12）纵切面上几乎见不到髓鞘腔和髓鞘，大多是疤痕、结缔组织和变性的神经纤维.

　　3讨论

　　神经系统的发展和维持依赖着神经营养因子. 最初，人们只注意神经营养因子对神经细胞损伤后的修复作用， 而很少留意它们对周围神经再生的影响.图1实验组近端坐骨神经(绿色点状为轴索

　　近10余年来，出现了一大批有关MDNF的研究证明MDNF对神经元具有促进生长、减少死亡等功能. 现已证明，大鼠MDNF对神经细胞凋亡有很好的抑制作用，它不但能够挽救胎龄6~9 d凋亡期的1/4运动神经元不死亡，而且几乎可使新生鼠切断后的运动神经元全部存活. 大鼠MDNF是否也象其他神经营养因子一样对周围神经损伤后的修复有促进作用呢？本实验研究发现，坐骨神经损伤后，经MDNF孵育的实验组远端在轴索数、轴索直径和髓鞘厚度均高于实验对照组. 在周围神经中，髓鞘厚度、轴索直径、轴索数被用来评价神经再生［4］. 结果说明，MDNF对周围神经损伤后的再生有促进作用. 研究还发现，实验组HRP标记的神经元数以及Nissl染色的神经元数均比实验对照组高；特殊三色染色中，实验组坐骨神经损伤段远端纵切面上仍有大量的块状髓鞘碎片，而实验对照组中髓鞘碎片大部分消失，且实验组坐骨神经损伤段有新生的髓鞘生成. 结果说明，MDNF对周围神经损伤的修复有促进作用. 但另一方面，实验组的髓鞘厚度、轴索直径、轴索数、HRP标记的神经元数、Nissl染色的神经元数均低于正常对照组，MDNF对周围神经损伤的修复也是不完全的. 肌源神经营养因子对周围神经再生有促进作用，至于MDNF是如何促进周围神经再生以及其促进再生的发生率均有待于进一步研究.

　　［1］ Yin Q， Kemp GJ， Yu LG， et al. Neurotrophin4 delivered by fibrin glue promotes peripheral nerve regeneration［J］. Muscle Nerve， 2001，24(3):345-351.

　　［2］ Shen N， Zhu J. Experimental study using a direct current electrical field to promote peripheral nerve regeneration［J］. J Reconstr Microsurg， 1995，11:189-193.

　　［3］ 周长满， 陈彪， 王雪岷，等. 骨骼肌组织对鸡胚背根节细胞GABA表达的影响［J］. 解剖学报， 1997，28(1):373-378.

　　［4］ Llewin SL， Utley DS， Cheng ET， et al. Simultaneous treatment with BDNF and CNTF after peripheral nerve transection and repair enhances rate of functional recovery compared with BDNF treatment alone［J］. Laryngoscope， 1997，107:992-999.