缺氧诱导因子-1α和细胞周期素E在骨肉瘤中的表达及其预后意义

作者：殷磊，茹江英，胡玉华，

【摘要】 ［目的］ 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和细胞周期素E （cyclinE）蛋白表达情况与骨肉瘤生物学特性的关系及预后意义。［方法］ 采用免疫组化SP法检测36例骨肉瘤组织中HIF-1α和cyclinE的表达情况，并分析与临床病理参数及预后的关系。［结果］(1)HIF-1α、cyclinE蛋白在骨肉瘤中的阳性率和平均阳性标记指数分别为［61.6%（22/36），（19.64±8.78）、55.6%（20/36），（19.20±9.27）］；（2）HIF-1α和cyclinE蛋白表达的一致符合率为65.8%，且两者表达呈正相关（r=0.7435，P﹤0.05）；（3）HIF-1α、cyclinE蛋白表达强度与骨肉瘤细胞分化程度密切相关（P﹤0.01）；(4)有转移组病例的HIF-1α蛋白表达强度高于无转移组病例（P﹤0.01）；（5）单因素和多因素生存分析显示HIF-1α、cyclinE高表达与患者预后不良有关（P﹤0.05）。［结论］HIF-1α、cyclinE高表达可能参与骨肉瘤的恶性进展，二者的联合检测对评价骨肉瘤患者的预后有一定价值。

【关键词】 骨肉瘤； 缺氧诱导因子-1α； 细胞周期素E； 预后

　　Abstract: ［Objective］To investigate the expressions of HIF-1α and cyclinE in osteosarcoma and their relationships with biological characteristics and prognostic value. ［Method］The expressions of HIF-1αand cyclinE were examined by SP Immunohistochemical staining in 36 osteosarcoma tissues.The profile was correlated with clinicopathologic parameters and prognosis.［Result］(1)The positive rate and average value of positive label index of HIF-1αand cyclinE was ［61.6%（22/36），（19.64±8.78）、55.6%（20/36），（19.20±9.27）］respectively；(2) The expression conformation rate of HIF-1αand cyclinE was 65.8%，and there was a statistically significant positive correlation between expressions of HIF-1α and cyclinE（r=0.7435，P﹤0.05）； (3) The positive intensity of HIF-1α and cyclinE expressions correlated with cell differentiation of osteosarcoma closely（P﹤0.05）；(4) The positive intensity of HIF-1α expressions in patients with tumor metastasis was higher than that in patients without metastasis（P﹤0.01）；(5)Univariate and multivariate survival analysis indicated that high expressions of HIF-1αand cyclinE correlated with poor prognosis of patients with osteosarcoma（P﹤0.05）.［Conclusion］With the increase in degree of malignancy，The high expressions of HIF-1αand cyclinE protein may participate in the malignant progression of osteosarcoma， their cojoined detection have a definite value in judging prognosis in osteosarcoma.

　　Key words：osteosarcoma； hypoxia-inducible factor -1α； cyclinE； prognosis

　　骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，预后差。由于骨肉瘤的发生与某些基因的异常表达有关，通过调控这些基因的表达来诱导骨肉瘤细胞凋亡将使骨肉瘤的生长、转移受到极大抑制，对骨肉瘤的保肢治疗及提高患者的生活质量具有重大意义［1］。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和细胞周期素E(cyclinE)的表达异常与多种肿瘤的增殖侵袭及预后不良有关［2、3］，但它们在骨肉瘤中的表达及临床意义报道较少。作者采用免疫组织化学方法检测36例骨肉瘤组织中HIF-1α、cyclinE的表达，探讨它们在骨肉瘤发生发展中的作用及其与临床病理参数的关系和预后意义，为临床了解骨肉瘤的生物学行为，指导治疗和判断预后等提供理论依据。

1 材料与方法

　　1.1 临床病理资料

　　收集武警江苏省总队医院和东南大学附属扬州医院1998年10月～2002年10月骨肉瘤标本的存档蜡块36例，全部病例HE染色切片均重新复读确诊，其中男20例，女16例；年龄11～36岁，平均年龄21.4岁；根据CT扫描获得肿瘤体积，其中≤20 cm319例，＞20 cm317例；发现转移者15例；病理分型：骨母细胞型12例，软骨母细胞型5例，纤维母细胞型4例，骨旁骨肉瘤6例，小细胞型6例，未分型3例，其中高分化组14例，低分化组22例；36例患者术前均未行任何治疗，按Enneking外科分期：ⅠA期0例，ⅠB期4例，ⅡA期10例，ⅡB期14例，ⅢA期5例，ⅢB期3例。本组病例平均随访36个月，共死亡23例，失访5例。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　1.2.1 主要试剂

　　小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、小鼠抗人cyclinE单克隆抗体、生物素标记Ⅱ抗及酶标avidin、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.2.2 实验方法

　　所用标本均先脱钙处理，再以4%甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，连续切片4 μm厚，贴附于预先用1%多聚赖氨酸处理的载玻片65℃烤片1.5 h，采用SP法检测，以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。

　　1.2.3 结果判断

　　采用阳性标记指数（LI%）定量计数染色结果，即在每张切片阳性细胞最多的区域计数500～1 000个细胞，按LI%=［阳性细胞数/总细胞数］×100%，计算出每例的LI%，每组数据用（x-±s）%表示。

　　1.3 随访

　　生存期按月计算，以首次手术日至死亡日或至末次随访日的完全数据或截尾数据为准，死于其他疾病归为失访。随访内容包括：患者死亡与否、肿瘤转移和复发情况等。

　　1.4 统计学方法

　　采用确切概率法、方差分析、直线相关分析、long-rank检验及COX比例风险模型生存分析。

2 结果

　　2.1 HIF-1α和cyclinE在骨肉瘤中的表达情况

　　HIF-1α和cyclinE蛋白阳性分别定位于肿瘤细胞的胞质（图1）和胞核（图2），呈棕黄（褐）色细颗粒状，且分别在22例（61.6%）和 20例（55.6%）骨肉瘤中出现阳性表达，其平均阳性标记指数分别为（19.64±8.78）、（19.20±9.27）。 图1HIF-1α蛋白阳性定位于骨肉瘤细胞质 免疫组化SP×400 图2cyclinE蛋白阳性定位于骨肉瘤细胞核 免疫组化SP×6002.2 HIF-1α和cyclinE表达与临床病理学参数的关系

　　单因素方差分析显示，HIF-1α、cyclinE表达与肿瘤细胞分化程度及转移有明显关系，而与其他因素无关。低分化、有转移组骨肉瘤中HIF-1α、cyclinE的表达明显高于高分化、无转移组病例（见表1）。

　　2.3 HIF-1α和cyclinE表达的相关性分析

　　骨肉瘤中HIF-1α和cyclinE蛋白的表达一致性符合率为65.8%(kappa值)。直线相关分析显示，HIF-1α和cyclinE蛋白在骨肉瘤中表达呈正相关性（r=0.7435，P<0.05，图3）。

　　2.4 HIF-1α和cyclinE表达与预后的关系

　　long-rank单因素生存分析显示，细胞分化程度、临床分期、转移、HIF-1α和cyclinE表达对患者预后有影响（P值分别为0.0341、0.029、0.0205、0.0011、0.008），而性别、年龄、肿瘤体积对预后的影响无统计学意义。将上述有意义的5个指标引入COX比例风险模型进行多因素生存分析显示，细胞分化程度、HIF-1α和cyclinE表达是骨肉瘤预后相关的重要因素，HIF-1α和cyclinE高表达提示患者预后不良（见表2）。

3 讨论

　　缺氧是恶性实体肿瘤微环境的重要特征，对肿瘤的生物学行为及预后有明显影响。不仅会导致肿瘤细胞对放化疗的抗拒性增加，而且使肿瘤细胞具有侵袭性，更容易发生远处转移。其中缺氧诱导因子-1α是恶性肿瘤适应低氧微环境的核心调控因子，激活后可调节下游多种靶基因的转录，对维持肿瘤细胞的无氧代谢，新血管生成、促进肿瘤成活、生长和转移都起到很重要的作用［4］。本研究观察发现， HIF-1α在骨肉瘤组织中高表达，且随着肿瘤细胞分化程度的降低，HIF-1α表达强度呈渐增趋势，提示HIF-1α异常高表达可能参与骨肉瘤的形成和肿瘤细胞的持续增殖［5］。这可能是由于不断生长的肿瘤组织中养份需求量过高，使众多瘤细胞处于严重缺氧状态，导致HIF-1α基因被启动表达，使瘤细胞提高适应缺氧能力［6］，此时HIF-1α的降解被阻断，得以在细胞内大量蓄积。部分骨肉瘤组织中HIF-1α蛋白呈阴性表达可能是由于肿瘤组织存在异质性而使HIF-1α在骨肉瘤中分布不均所致，或骨肉瘤特殊的组织学类型使其在组织固定过程中必须经过脱钙处理，导致抗原丢失过多所致。结合临床病理参数的研究发现有转移组病例的HIF-1α蛋白表达强度高于无转移组病例，提示其高表达可能与骨肉瘤转移有关。推测HIF-1α可能通过上调血管内皮生长因子表达而促进肿瘤血管形成，进而促使肿瘤细胞转移［7］，其确切机制有待深入研究。 表1 骨肉瘤中HIF-1α和cyclinE蛋白表达与临床病理参数的关系临床 病理参数例数HIF-1α蛋白表达阳性标记指数表2 骨肉瘤多因素COX模型回归变量表变量回归 共表达3.0100.7484.0240.0011.544～4.476图3HIF-1α和cyclinE表达散点图

　　肿瘤的发生发展与细胞周期调控失衡有关。细胞周期紊乱是基因组不稳定的一个中心环节，可使不稳定细胞进一步恶变的几率增加，从而参与肿瘤的形成与演进［8］。cyclinE是细胞周期G1/S期转换主要限速因子之一，其表达受细胞周期调节。人类cyclinE基因定位于19q12～13，有4个外显子和3个内含子，其编码蛋白含有395个氨基酸，为核内蛋白。cyclinE过表达可促进细胞由G1期进入S 期过度增殖形成肿瘤，目前已知在人类多种肿瘤中均存在cyclinE过表达。本研究发现，cyclinE在骨肉瘤组织中广泛表达，提示cyclinE表达上调促进了细胞周期进行及细胞增殖，与骨肉瘤的发生有关［9］。本研究结果显示，在恶性程度高的低分化骨肉瘤中cyclinE表达率较恶性程度低的高分化骨肉瘤明显升高，提示cyclinE过表达与骨肉瘤的恶性转型及分化不良有关，随着骨肉瘤恶性程度的增加，cyclinE 促进肿瘤细胞增殖的作用增强，呈现明显的生长优势［10］。

　　肿瘤细胞对缺氧的适应以及细胞周期调节失控是骨肉瘤发生发展的生物学基础，已证实HIF-1α和cyclinE可在不同环节导致肿瘤细胞异常增殖而形成肿瘤。本研究发现，HIF-1α和cyclinE蛋白表达呈正相关趋势，提示二者可能通过某些机制协同促进肿瘤细胞增殖周期的进程，导致骨肉瘤恶性进展。这可能由于肿瘤细胞的过快增殖导致其呈严重缺氧状态，虽然这种缺氧可使肿瘤细胞周期阻滞，但缺氧诱导的HIF-1α高表达可能通过影响肿瘤细胞G1/S点进而促进肿瘤发展［3］。另外，单因素和多因素生存分析均显示HIF-1α和cyclinE过表达提示骨肉瘤患者预后不良。因此，作者认为二者表达的正相关模式涉及骨肉瘤的启动和发展过程，联合检测HIF-1α和cyclinE蛋白可作为判断骨肉瘤发展趋势及评价预后的免疫学指标，并对今后开展HIF-1α和cyclinE靶向基因治疗有重要意义。但本组研究病例尚少，关于HIF-1α和cyclinE蛋白表达在骨肉瘤发生发展中的确切作用及预后价值，还有待于积累更多病例及进行更深入的研究证实。

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