不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响

　　　　　　　　　　作者：李盛，石汉平，孙冠青，孟锐

【摘要】 　　

【关键词】 创伤愈合 成纤维细胞 血糖 应激反应　　
　　Abstract： Objective To find the relationship between glucose concentration and the proliferation of fibroblast.Methods The proliferation of mouse fibroblast was tested in different concentration of glucose at 12h，24h，48h with CCK kit.The amount of the outcell type I collagen fibers was tested by the mouse type I collagen Elisa kit，and the expression of αsmooth muscle actin (αSMA) tested by immunochemistry.Results We found that under the medium of low concentration，the proliferation was much more than that in the high concentration groups after 12h，24h and 48h(P0.05).About the expression of mouse αSMA，positive correlation was found between the glucose concentration and the expression of the mouse αSMA.Conclusion At the original augmentation of the blood glucose，the proliferation of fibroblast is not different.But when it gets over a level，the proliferation will be depressed，which can lead to the delay of the healing of raw surface；the concentration of glucose has nothing to do with the outcell type I collagen fibers；the concentration of glucose is a factor which enhances the variation from fibroblast to myofibroblast，and the concentration of glucose is positively correlated with the tendency of the variation.
　　
　　Key words：wound healing;fibroblast;blood glucose;stress reaction
　　
　　在外科危重患者中常常遇到高血糖，其中主要是存在许多糖尿病患者，糖尿病损伤修复时，损伤组织的高糖环境对成纤维细胞的生长有着很大影响，使得创面愈合这一过程变得更为复杂。血糖持续升高可使机体产生一系列的不良反应，增加机体高渗性昏迷、糖尿病酮症酸中毒发生的可能性， 严重危及生命。高血糖的发生提示机体处于代谢紊乱状态， 其持续存在更增加了感染的风险。因此如何应对创伤伴随高血糖并发症的出现，一直是创伤外科亟待解决的问题。
　　
　　创伤愈合是一个复杂而有序的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖、迁移，创面重塑等多个序贯又相互交叉的病理生理过程。研究已发现成纤维细胞（fibroblast）在此修复过程中起着十分重要的作用。长期以来它也一直被视为是肉芽组织收缩的能量供应者，对伤口有效而迅速的关闭起着重要的作用。肌成纤维细胞被认为是由创口周围的皮肤、皮下组织中的成纤维细胞在各种刺激因子的作用下转变而来，其分泌的肌动蛋白（αsmooth muscle actin，αSMA）被普遍认为是肌成纤维细胞表型的可靠证据。本实验利用小鼠成纤维细胞培养，在体外模拟高血糖的环境，设定不同糖浓度，研究不同时间下成纤维细胞生长增殖情况和胶原合成情况，从而为了解不同糖浓度下成纤维细胞增殖情况奠定体外试验基础。

　　材料与方法

　　1 主要试剂
　　
　　胎牛血清高糖DMEM培养基（购自Gibico），Cell Counting Kit8试剂盒(购自碧云天试剂公司)，羊抗小鼠I型胶原抗体，羊抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa），兔抗羊二抗（购自Santa）小鼠I型胶原ELISA试剂盒（购自Sygma）。

　　2 实验方法

　　2.1 成纤维细胞的原代培养 取健康试验用家鼠（昆明小鼠），处死后将背部皮肤毛发刮去，酒精消毒，取3cm×3cm大小皮肤，用无菌剪刀剪去皮下脂肪组织，将皮肤剪碎后散落在无菌培养皿中，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养1周左右，带成纤维细胞迁出组织块后，剔去大块组织，继续培养，并传代多次后纯化等到成纤维细胞。

　　2.2 不同浓度糖培养液的制备 普通高糖DMEM培养基葡萄糖含量为25mmol/L（每升培养基含葡萄糖4500mg），加入一定量左旋葡萄糖后过滤，配置成糖浓度梯度为25、40、55、70、85mmol/L的培养液，其渗透压按照分别为5311、5603、5896、6181、6474mmHg，在正常值5311～6227mmHg范围内或稍高。依次为A、B、C、D、E 5个糖浓度组，按照普通组即A组相当于正常血糖值餐后高值7mmol/L，即各组相当于血糖值的7.0、11.2、15.4、19.6、23.8mmol/L。

　　2.3 成纤维细胞的鉴定和Ⅰ型胶原的组织学观察 采用爬片法，使成纤维细胞在特制放滑玻片上生长，待细胞生长到约占70％时，取出玻片，采用细胞免疫组化法（一抗为羊抗鼠I型胶原单克隆抗体，二抗为兔抗羊单克隆抗体）染色（购自Santa）。

　　2.4 成纤维细胞增殖的CCK测定 使用CCK8试剂盒检测 (购自碧云天试剂公司)。将细胞消化后加入到96孔板中，每孔加入100μl 2000个细胞，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E 5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，每孔加入10μl CCK8溶液，在细胞培养箱内继续孵育0.5～4小时，在450nm测定吸光度（其细胞数量和吸光度成正比）。

　　2.5 成纤维细胞I型胶原的Elisa测定 将细胞消化下后，按照细胞数1×104个/孔接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E　　5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，然后用移液管反复吹打孔底，吸上清，用鼠I型胶原Elisa试剂盒测定细胞外胶原的浓度。

　　2.6 成纤维细胞肌动蛋白的Westernblot 将细胞消化下后，按照同样的浓度接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E 5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，吸去上清后将培养皿放置在冰上，假如蛋白提取液提取细胞蛋白质，测定蛋白浓度，经过煮沸、制胶、蛋白上样，冰上电泳后转膜，封闭，加入一抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa）和二抗兔抗羊二抗（购自Santa）后，孵育，洗膜，曝光，检测肌动蛋白。

　　3 统计分析
　　
　　实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)。

　　结果

　　1 成纤维细胞的鉴定和I型胶原的组织学观察
　　
　　如图1为未加入一抗的对照组，不仅细胞未被染色，而且细胞间未观察到有被染色的I型胶原，这一点提示成纤维细胞所分泌之I型胶原纤维可能被吹打脱离培养瓶底部，或在体外培养中成纤维细胞分泌I型胶原较少。图2所示，加入一抗和二抗的样本中，成纤维细胞被染成棕色，细胞成多边形和长梭形，细胞较大；证实原代培养的细胞中成纤维细胞为主，且纯度较高。

　　2 成纤维细胞增殖的测定（CCK法）
　　
　　利用CCK试剂盒测定成纤维细胞的增殖，OD值和细胞数目成正比。结果如表1所示，在12、24、48小时处理后，A、B浓度下成纤维细胞殖速度明显大于后3组(P<0.01)。

　　3 成纤维细胞I型胶原增殖的测定（Elisa法）
　　
　　利用Elisa试剂盒测定细胞外胶原，如表2，结果显示每组均可检测到细胞外I型胶原的存在，统计结果显示其每组的成纤维细胞产生I型胶原的总量并无明显差别(P>0.05)。

　　4 成纤维细胞肌动蛋白的Westernblot测定
　　
　　对细胞进行既定处理后，对成纤维细胞肌动蛋白的表达做了半定量测定，如图3所示随着浓度的增加，成纤维细胞中表达肌动蛋白的量是上升的。

　　图1 未加入羊抗鼠I型胶原单克隆抗体的成纤维细胞（略）

　　图2 加入羊抗鼠I型胶原单克隆抗体的成纤维细胞（略）

　　从左到右依次为阳性对照，以及A、B、C、D、E各组浓度下成纤维细胞表达肌动蛋白的情况：A组几乎不表达，随着糖浓度增加，肌动蛋白量的表达依次增加。

　　图3成纤维细胞表达成纤维细胞肌动蛋白的表达（略）

　　表1 不同糖浓度培养成纤维细胞CCK法测定增殖的变化（略）

　　表2 不同糖浓度培养成纤维细胞Elisa法测定增殖的变化（略）

　　讨论
　　
　　创面愈合是一个复杂而有序的生物学过程，本研究模拟了外科危重患者创面愈合常见的干扰因素－高血糖，利用不同糖浓度培养基对小鼠成纤维细胞进行培养，观察了不同糖浓度下随时间变化的成纤维细胞增殖情况。
　　
　　外科危重患者中常见有高血糖，其原因首先是外科创伤或手术引起的应激反应导致机体分解代谢增加，糖原分解和糖异生作用的加强而出现应激性高糖血症，另一方面应激反应时确实存在着“胰岛素抵抗”［1，2］，血糖的持续升高可使机体产生一系列的不良反应，会加重病情、营养供给不足、增加并发症发生的几率、影响预后、甚者危及生命［3-9］。目前，应激性血糖升高可作为创伤严重程度的标记物。近期实验发现， 接受葡萄糖注射的大鼠肉芽组织生长不良， 阻碍创伤愈合［10］。
　　
　　成纤维细胞（fibroblast）疏松结缔组织的主要细胞成分，是功能活动旺盛的细胞，各种创伤造成的组织缺损，其修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。而肌成纤维细胞被认为是由创口周围的皮肤、皮下组织中的成纤维细胞在各种刺激因子的作用下转变而来的，aSMA被普遍认为是肌成纤维细胞表型的可靠证据。
　　
　　本次研究采用体外模型，以不同糖浓度的培养液（25、40、55、70、85mmol/L）作为影响因素，对成纤维细胞的生长、增殖以及蛋白合成进行了比较。鼠I型胶原细胞免疫组化实验中，我们可以看到，成纤维细胞均能正常生长，并且细胞间并没有看到被染色的Ⅰ型胶原纤维，提示成纤维细胞所分泌之I型胶原纤维可能被吹打脱离培养瓶底部，或在体外培养中成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原较少。我们利用CCK8试剂盒对于不同浓度下成纤维细胞的增殖情况进行计量：在基本浓度和较高浓度（25、40mmol/L）下，成纤维细胞的增殖并无太大差别，但是随着浓度的增加，成纤维细胞的增殖有明显下降之趋势（P0.05）。Ⅰ型胶原起到细胞间连接的作用，从增殖测定实验中我们可以看到在基本浓度和较高浓度（25、40mmol/L）下，成纤维细胞的增殖并无太大差别，但是随着浓度的增加，成纤维细胞的增殖有明显下降之趋势，说明在初始相同细胞接种数量（1×104个/孔）的情况下，刺激因子刺激之后每个浓度培养液下每组的细胞数量大致是不同的，但是测定的细胞外一型胶原的含量却并没有明显差异，而从实验结果我们猜测细胞外Ⅰ型胶原的量与细胞数量并无太大影响，细胞数量并不是影响成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原量的决定因素；最后我们对成纤维细胞肌动蛋白的表达做了半定量测定，根据蛋白电泳结果我们发现，随着糖浓度的升高，成纤维细胞表达成纤维细胞肌动蛋白的量随之升高，提示在应激高血糖情况下，皮肤成纤维细胞发生向肌成纤维细胞变异转化的几率也是增加的，应激高血糖可能是一种刺激细胞分化的条件，而这种分化所代表的意义也尚待解释，猜测这种细胞性质的转化会不会对皮肤张力等发生影响。
　　
　　由于是细胞体外培养，故培养液的糖浓度明显高于正常体内的血糖浓度。然而，我们可以做一个横向的比较，即用成纤维细胞培养基的基本浓度（25mmol/L）和正常的体内血糖浓度7mmol/L相关联，即可粗略的算出，在血糖低于11.2mmol/L时，血糖对机体创面愈合的影响不大，但是随着超过这一上限值，随着血糖浓度的升高，对于创面愈合的阻碍将越来越大。这一结论尚需要下一步动物实验的证实。

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